研究文章
确定黄瓜植物候选参考基因稳定化受Phytophthora melonis压力
Rui Wang、Hudu、QingminJin、Yu'e Lin、YujuanZhong、Chunpeng Yao、徐小梅和Tingqu
广东农科院/广东新技术实验室菜类研究所,中国广州510640
通讯通讯地址广东农科院/广东新技术实验室蔬菜研究所蔬菜研究所TingquanWu510640中国电话+86203846930电子邮件:tingquanwu@sina.com
日期 :提交者:2019年3月29日核准数 :2019年4月12日发布日期:2019年4月15日
如何引用此文章王RDUHQLINYLINYET等确定黄瓜植物候选参考基因稳定化受Phytophthora melonis压力PlantSci Phytopathol20193:028-035DOI:10.29328/journal.jpsp.1001028
版权许可:2019 王R等必威体育西汉姆联允许媒体不受限制使用、分发和复制, 前提是原创作品正确引用
关键字 :黄瓜参考基因;P.百合素脱机Gene稳定
抽象性
稳定参考基因对确保确定基因表达水平的忠实性不可或缺表达式参考基因无法在所有可能的实验条件下保持恒定因此,稳定判断参考基因对实验系统集是必不可缺的预置研究中九大黄瓜候选参考基因的稳定性C级s级CA,C级s级UBQC级s级EF1A,C级s级CYP,C级sffaTU,C级s级CACS系统,C级s级TIP41,C级s级YSL8并C级s级高尔市受重力调自菲托福索拉梅洛尼斯高山市P.百合素)用四种不同的分析方法测定,包括DeltaCt、BestCaster、NormFinder和GeNorm研究结果显示C级s级UBQ并C级s级CYP最稳定的基因适合黄瓜厂内部控件P.百合素条件详解
导 言
基因表达分析对基因函数研究非常重要定量RT-PCR(qRT-PCR)可靠特性高敏感度qRT-PCR只有在实验数据正常化时才能可靠此外,参考基因可靠性对数据正常化至关重要[3-5]某些管家基因参与基本生物活动,如UbaitinUBQActinCA长因子1-alphaEF1α常使用内部控件,因为这些控件被视为常量表达式,而不管实验条件如何 [6,7]因为这些基因对基本细胞生活是必备的,它们的表达层次在不同条件中被认为是恒定的。增加研究显示这些基因的表达水平不独立于实验条件[8,9],当植物生长开发的不同阶段或环境条件不同时参考基因的稳定性不同[2,9-13]最合适的参考基因应常数表达于植物中,而不应受植物内部因素和外部环境[414]的影响因此,非常有必要选择稳定参考基因,以便按qRT-PCR对在不同条件下采集的样本中目标基因作高效量化Delta-Ct[15]、BestPaster[16]、NormFinder[17]和GeNorm[18]
黄瓜成员中最重要的成员库尔比切亚家庭遍及世界黄瓜基因排序数据发布后,黄瓜分子生物学研究已取得重大进展[19-23]黄瓜薄膜由菲托福索拉引起美兰地P.百合素是一种破坏性疾病,导致部分受影响田地增产、质量和增产损失高达80%研究黄瓜机制P.百合素交互作用很少报告,只有几篇论文发布CsLerk6.1发现它特别导引P.百合素和PJSH黄瓜厂25个CsLecrk基因组[25]并基于RNASeq和qPCR结果,CsWKY22026354452菲托福索拉梅洛尼斯SA和JA信号路径因此,找到一个或多个稳定参考基因研究受感染基因函数有重大价值和意义
材料方法
植物材料、生长条件和处理
整个研究使用B80栽培厂的黄瓜植物生长室2628摄氏度,相对湿度85%,光线10小时14小时十天老树苗用于实验地下植物由动物园悬浮处理P.百合素5x103动物园/ml),根茎和树叶混合采集RNA处理后0、6、12、24和48小时提取,24-48小时显出表征黄瓜植物Pheno类型CK(不接种)和48h后用P.百合素5x103动物园/ml显示于补充图1P.百合素V8固态培养介质和动物园介质V8果汁从CampbellSup公司购买V8液化培养介质一升含200毫升清晰V8果汁,3克CaCO3和约800毫升dH2O/Ph=5.8V8固态培养介质一升包含液介质+16ga
图1排名候选参考基因 根据GeNorm分析值为三次独立生物重复实验平均值稳定值表示基因的稳定性,最稳定的基因最小稳定值确定基因稳定值小于1.5时,基因可类为参考基因
实验设计
九黄瓜基因C级s级CA,C级s级UBQC级s级EF1s级,C级s级CYP,C级sffaTU,C级s级CACS系统,C级s级TIP41,C级s级YSL8并C级s级高尔市)通常被选择为参考基因 在某些实验条件中, 所以我们预测其中 或部分可能像参考基因 受黄瓜植物感染P.百合素.每种候选参考基因表达式测试5分数(0、6、12、24和48小时)P.百合素.候选参考基因稳定使用四种不同分析方法确定,包括DeltaCt、BestCaster、NormFinder和GeNorm最后,我们合并这些结果筛选出实验系统最稳定的参考基因
RNA隔离和qPCR分析
qRT-PCR使用BIO-RADCX96实时PCR系统(Bio-Rad,USA)和SYBR前缀aqTM二混合包(Takara)全RNA使用RNAiso+试剂(takara)提取并使用PrimeScriptTMRT试剂Kit合成cDNA生成cDNA十倍稀释前缀aqTM二10微升容量程序如下:95摄氏30秒,30循环95摄氏5秒,60摄氏15秒,72摄氏15秒三次实验和三次生物复制分析引用基因表达式
原创文化P.百合素并准备动物园悬停
P.百合素广东农科院Baiyun实验田从黄瓜植物隔离开来,这些植物在V8固态文化介质中培养10%V8l文化介质添加新片2至3天,将aclia放入水中2天促发ragia生产,水每12小时更新一次动物园释放导出物为4摄氏度30分水分数,动物园数目由显微镜测定,动物园悬浮调整为5x103动物园/毫升
黄瓜候选参考基因稳定性分析法
黄瓜候选参考基因的稳定性使用目前可用的主要计算程序分析,如Delta-Ct、Bestdepreer、NormFinder和GeNorm,以便比较测试候选参考基因并排排序
结果
纹理剖析黄瓜候选参考基因
以便识别最稳定的参考基因研究黄瓜基因表达式P.百合素九大候选参考基因素数黄瓜表1分别设计为qRT-PCR测试基于SYBR绿色检测qRT-PCR放大特征通过PCR产品单值熔化曲线确认(图2)。表达式参考基因混合根干和树叶,并分别显示阈值周期(Ct)值(表23)。
图2熔曲线分析产品放大候选参考基因熔曲线分析9候选参考基因s级-CACs-UBQC级s级-EF1AC级s级CYPCs级-ATUCs级CACS-TIP41Cs-YSL8Cs-HEL)实施实验重复三次,结果相似
| 表1黄瓜候选参考基因 素数序列和产品大小 | |||||
| 加入号 | 注释性 |
Forward primer (5′-3′) | 逆向素数(5+3+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ | 产品大小 | |
| Csa017310 | Actin(Cs-CA) | A级CAGCCGATGA CAGTC |
CGGTCAGCGATACCAGGGAAC | 214 | |
| Csa000874 | UbiquitinUBQ) | GGTAGAAGAGA CCACACACA |
CCTTTCCAGAGTCATCGACCT | 105 | |
| Csa006172 | 延时因子1-aEF1A) | CATTATCAAGAACATGATTAC | TTCCTTCACAATTTCATCG | 230 | |
| Csa014027 | Cs-CYP | GGAAATGGTACAGGAGGTG | CATACCCACGCATGAC | 201 | |
| Csa021066 | Alpha图例 | CATTCTCTCTTGGAACACCAGA系统 | TCAACAGGCAGTTAAAGATGAAA | 254 | |
| Csa018705 | Clathrin复用子单元 | TGGGAAGATTCTTATGAAGTGC | CTCGTCAAATTTACACATTGGT | 171 | |
| Csa003506 | PP2A磷作用器 | ACAGATGATATATAC | GCCAGCTCATCCTCATATAAG | 221 | |
| Csa012471 | 寄生虫蛋白 | CCTTGTGGATATCACAGAAGTT | CTTGTTTATCCTTGAGTGCC | 155 | |
| Csa015849 | Helicasecase-Cs-HEL | TTCTGAGATCATGG | CAATGGACGAATGCAAAGG | 168号 | |
| 表2黄瓜候选基因Ct值 | |||||||||
| 循环后处理 | s-CA | s-HEL | Cs-CYP | s-EF1A | Cs-TIP41 | Cs-ATU | s-UBQ | CS-CACS | s-YSL8 |
| 0 | 21.75 | 18.39 | 20.59 | 22.41 | 26.08 | 23.96 | 21.02 | 27.01 | 29.04 |
| 6 | 21.80 | 32.01 | 19.86 | 23.08 | 26.52 | 21.66 | 20.84 | 25.68 | 28.47 |
| 12 | 20.20 | 27.72 | 18.90 | 20.27 | 24.37 | 21.11 | 19.74 | 23.95 | 27.42 |
| 24码 | 21.92 | 32.44 | 19.70 | 21.06 | 2580 | 23.26 | 20.76 | 25.97 | 27.99 |
| 48号 | 22.94 | 26.85 | 20.97 | 22.96 | 26.05 | 23.69 | 21.01 | 24.84 | 27.18 |
| 注释 :样本来自三次重复生物实验的根值和蒸气值和Ct值 | |||||||||
| 表3黄瓜候选基因Ct值 | |||||||||
| 循环后处理 | s-CA | s-HEL | Cs-CYP | s-EF1A | Cs-TIP41 | Cs-ATU | s-UBQ | CS-CACS | s-YSL8 |
| 0 | 21.39 | 29.57 | 19.80 | 21.69 | 25.16 | 24.09 | 20.01 | 26.60 | 28.25 |
| 6 | 21.93 | 30.08 | 20.22 | 23.25 | 25号 | 21.04 | 20.05 | 24.40 | 29.03 |
| 12 | 22.32 | 27.85 | 18.61 | 21.16 | 25.38 | 20.72 | 20.17 | 25码 | 27.86 |
| 24码 | 20.97 | 33.76 | 21.19 | 21.40 | 26.65 | 24.55 | 20.30 | 25.01 | 26.31 |
| 48号 | 23.30 | 28.30 | 20.29 | 21.81 | 26.43 | 23.99 | 20.57 | 25.02 | 27.73 |
| 注释:样本取叶子,Ct值为三次重复生物实验平均值 | |||||||||
熔曲线分析9候选参考基因CACs-UBQCs-EF1ACs-CYP、Cs-CATU、Cs-CACS、Cs-TIP41、Cs-YSL8、Cs-HEL)以0.1-0.5um素底集中度和5-50ng模板cDNA最终集中度实现实验重复三次,结果相似
GeNorm分析
GeNorm选择参考基因的标准是最稳定的基因最小稳定值,当确定基因稳定值小于1.5时,基因可与参考基因相同。黄瓜根茎结果显示sHEL除外八大基因稳定值小于1.5和黄瓜叶稳定值五大基因稳定值C级s级UBQ,C级s级CYP,C级s级CA,C级s级CACS系统并C级s级TU值小于1.5(图2)。┮C级s级UBQ,C级s级CYP,C级s级CA,CSCACS系统并Cs#TU可像黄瓜叶或根部参考基因并发根使用GeNorm分析P.melonis接种条件
最佳屏蔽分析
最佳保护者选择参考基因的标准是最稳定的基因拥有(或拥有)最小SD值,当SD值小于1时,基因可以作为参考基因
黄瓜根根分析显示两种基因C级s级UBQ并C级s级CYP达到参考基因标准(表4)。黄瓜叶最佳屏蔽分析显示结果相同Cs系统UBQ并CSCYPSD值小于1达参考基因标准(表5)。SoC级s级UBQ并C级s级CYP适合参比基因黄瓜根部和树枝或叶部
| 表4黄瓜候选参考基因的表达稳定性值 根和黄瓜根由最佳保存者计算 | |||||||||
| 实验一 | CsACT系统 | CshEL | CSCYP | Cs系统EF1A | CstiP41 | CSATU | Cs系统UBQ | CSCAs | sYSL8 |
| 地理均值 | 21.67 | 29 | 19.98 | 21.88 | 25.73 | 22.67 | 20.66 | 25.46 | 27.96 |
| AR均值 | 21.72 | 27.48 | 20.00 | 21.96 | 25.76 | 22.74 | 20.68 | 25.49 | 28.02 |
| 分钟[CP | 20.18 | 16.81 | 18.64 | 19.72 | 23.86 | 20.41 | 19.74 | 23.73 | 25.35 |
| 最大[CP | 23.88 | 33.21 | 21.03 | 24.43 | 27.87 | 25.12 | 21.72 | 27.35 | 30码 |
| stddev+/-CP | 1.24 | 4.91 | 0.73 | 1.57 | 1.6 | 1.45 | 0.60 | 1.14 | 1.52 |
| CV[%CP | 5.68 | 19.14 | 3点68分 | 7.14 | 4.47 | 6.32 | 2.84 | 4.47 | 5 44 |
| 分钟[x分 | 324 | -32.15 | 2.63 | 4.98 | -3.70 | 4.81 | -2.23 | -3.55 | 6.31 |
| 最大[x分 | 4.7 | 26.15 | 2.15 | 6.76 | 4.62 | 5.68 | 2.16 | 3-96 | 7 |
| stddev+/-x- | 239 | 272.54 | 1.68 | 3点5分 | 2.25 | 2.80 | 1.57 | 2.21 | 2.87 |
| 表5黄瓜候选基因表达稳定性由最佳保留者计算 | ||||||||||
| 实验一 | CsACT系统CshEL | CSCYP | Cs系统EF1A | CstiP41 | CSATU | Cs系统UBQ | CSCAs | sYSL8 | ||
| 地理均值 | 21.94 | 29.76 | 19.99 | 21.80 | 25号 | 22.79 | 20.22 | 25.67 | 27.76 | |
| AR均值 | 21.98 | 29.91 | 20.02 | 21.86 | 25.85 | 22.88 | 20.22 | 25.71 | 27.84 | |
| 分钟[CP | 20.29 | 26.55 | 公元19.00 | 19.68 | 23.96 | 20.79 | 19.74 | 23.44 | 24.76 | |
| 最大[CP | 23码 | 33.76 | 21.59 | 24.06 | 27号 | 25.23 | 20.59 | 27.27 | 30.58 | |
| stddev+/-CP | 1.19 | 276 | 0.85 | 1.37 | 一二八 | 1.65 | 0.28 | 1.08 | 1.76 | |
| CV[%CP | 5.43 | 9.25 | 4.23 | 6.27 | 4.92 | 7.17 | 1.37 | 4.21 | 6.27 | |
| 分钟[x分 | -2.75 | 16.68 | -2.76 | -4.65 | -3.70 | -8.73 | -1.42 | 5.25 | -8.24 | |
| 最大[x分 | 389 | 17.92 | 3.11 | 6.01 | 4.49 | 5.54 | ..... | 3.12 | 7.78 | |
| stddev+/-x- | 2.32 | 6.84 | 1.80 | 2.65 | 2.47 | 3.22 | 1.22 | 2.14 | 3.52 | |
排序基因稳定由Bestworder:
Cs系统UBQ>C级s级CYP>C级s级CACS系统>C级s级TIP41>C级s级CA>C级sffaTU>sYSL8>CsEF1A>CshEL
0.60.0.73 (1.14) (1.16) (1.44) (1.52) (4.5) (4.5.57) (4.91)
____________________________________________________________________________________________________________________注释:值为三次独立生物重复实验平均值最稳定的基因有最小SD值,当SD值小于1时,基因稳定并可作为参考基因
排序基因稳定由Bestworder:
C级s级UBQ>C级s级CYP>C级s级CACS系统>C级s级CA>C级s级TIP41>Cs级EF1α>CSATU>sYSL8>CshEL
0.28.0.85.1.08.
______________________________________________________________________________________________________________________注释:值为三次独立生物重复实验平均值最稳定的基因有最小SD值,当SD值小于1时,基因稳定并可作为参考基因
NormFinder分析
normFinder选择参考基因的标准是最稳定的基因最小稳定值使用方法,我们只能排序基因稳定并选择最稳定的基因为参考基因九大候选参考基因用NormFinder法分析三次重复实验
黄瓜根茎或树叶结果显示C级s级UBQ并CSCYP排名前2位和图3Comprehensively,C级s级UBQ并C级s级CYP最优基因参考基因P.百合素受感染条件
图3排名候选参考基因 根据NormFinder分析值为三次独立生物重复实验平均值稳定值表示基因的稳定性,最稳定的基因拥有或拥有最小稳定值
三角洲CT分析
DeltaCT选择参考基因的标准是最稳定的基因拥有或拥有最小STDEV值,类似于NormFinder使用DeltaCT方法,我们可以测序基因稳定度并判定最稳定的基因三角洲CT分析显示C级s级UBQ并C级s级CYP在所有实验中最稳定的基因(表6.7)。
| 表6STDEV平均值和黄瓜候选基因排序 | |||||||||
| CsACT系统 | CshEL | CSCYP | Cs系统EF1A | CstiP41 | CSATU | Cs系统UBQ | CSCACS系统 | sYSL8 | |
| STDEV值 | 2.04 | 7.2 | 2.02 | 239 | 2.21 | 2.36 | 1.91 | 2.21 | 2.85 |
| 排名顺序 | 3 | 8 | 2 | 6 | 4 | 5 | 一号 | 4 | 7 |
| 注释 :值为三次独立生物重复实验平均值DeltaCT选择参考基因的标准是最稳定的基因拥有或拥有最小STDEV值 | |||||||||
| 表7平均STDEV值和黄瓜候选基因排序 | |||||||||
| CsACT系统 | CshEL | CSCYP | Cs系统EF1A | CstiP41 | CSATU | Cs系统UBQ | CSCACS系统 | sYSL8 | |
| STDEV值 | 2.54 | 3.54 | 2.05 | 2.31 | 2.35 | 2.54 | 1.9 | 2.34 | 2.68 |
| 排名顺序 | 6 | 8 | 2 | 3 | 5 | 6 | 一号 | 4 | 7 |
| 注释 :值为三次独立生物重复实验平均值DeltaCT选择参考基因的标准是最稳定的基因拥有或拥有最小STDEV值 | |||||||||
讨论
提议数种方法评价参考基因表达式的稳定性,例如GeNorm、BestCraper、NormFinder和Delta-Ct方法本研究使用四种分析方法比较九大黄瓜候选参考基因排名C级s级CA,C级s级UBQ,C级sffaTU,C级s级CYPC级s级EF1α,C级s级CACS系统,C级s级高尔市,C级s级YSL8并C级s级TIP41下)P.百合素受感染条件可选择适合参考基因的基因使用GeNorm和BestPaster方法,最稳定的基因使用NormFinder和Delta-Ct方法确定分析结果与这四种方法不完全相同,有时大相径庭。有五大基因Cs系统UBQ,C级s级CYP,C级s级CA,C级s级CACS系统并C级s级TU适配参考基因GeNorm法并Cs系统UBQ并CSCYP适合作为黄瓜植物参考基因令我们兴奋Cs系统UBQ并CSCYP也是使用NormFinder和Delta-Ct两种方法最稳定的基因SoC级s级UBQ并C级s级CYP视之为最稳定的基因 适配九大基因中的参考基因 条件黄瓜植物受P.melonis感染
黄瓜植物受生长调控 非生物压力C级s级CACS系统,C级s级TIP41和Cs级EF1α最优参考基因,稳定排序C级s级CA,C级s级UBQ,C级sffaTU并C级s级CYP排名低[9]研究结果显示Cs系统UBQ并CSCYP最稳定的参考基因 条件黄瓜植物受P.百合素.研究结果显示,在生物压力条件下,黄瓜植物参考基因稳定与非生物压力或生长调节条件不同,为未来研究打下坚实的基础。
感知感知
工作得到了中国国家关键研发方案(2018YFD0100702)和广州科技创新委员会关键项目(201804020047)的支持。广东自然科学基金会(2016A030313777)、广州农业开发专用基金(1710023)和广东省作物Germplasm资源库项目
引用
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