变换的另一种方法辣椒物种

辣椒辣椒作为蔬菜作物和药用植物具有很高的经济价值。大部分的辣椒对植物再生的抗性是已知的吗在体外，以遗传转化为根癌土壤杆菌．然而，对病原体的遗传改善需要发现新的害虫抗性基因并揭示其功能和机制在体外．改进的转化方法的发展为此目的是需要一种携带感兴趣的基因的二元载体技术被转移到宿主植物中。农杆菌属rhizogenes中介转换是一种有用的替代方法辣椒转型。这A. rhizogenes.转换与农改造方法的优点是不需要再生步骤在体外．

我们的目标是获得一种高效的转型系统，可用于研究不同基因的功能辣椒建立品种。我们的研究进一步的目标是验证和描述候选基因（我1)涉及对根结线虫的抗性。

辣椒种具有很高的经济价值，长期以来一直是世界范围内重要的粮食作物。它是家族中第二重要的作物茄科在番茄[1]。辣椒基因的研究正面临着主要的障碍辣椒对植物再生具有抗性在体外，以遗传转化为根癌土壤杆菌[2]．农介导的转化辣椒物种依赖于植物的多样性，表现出低的转化效率。目前的研究表明了这一发现农可应用于广泛范围的中介转换协议辣椒基因型在此刻似乎是不现实的[3,4]。

A. rhizogenes.（革兰氏阴性土壤细菌）携带根系诱导质粒，包括RI T-DNA（21,595bp; EF433766），其导致植物中的“毛茸茸的根”表型[5,6]。该方法还被广泛地用于产生次级代谢物，以研究引起根瘤染色和根部发育中所涉及的基因的功能，并确认基因的功能参与抗根病原体的抵抗力[7]。关于根疾病，根转换A. rhizogenes.是验证候选基因功能的一种聪明的替代方法。

根结线虫，有属世界性植物根寄生线虫。线虫造成的养分损失和损害降低了受感染植株的根和茎的生长、光合能力和严重的产量损失。超过98有物种已被鉴定为[9]，其中三种(m .隐姓埋名的女人那m是那m . arenaria）广泛分布并具有广泛的宿主植物。在感染期间，第二阶段线虫幼稚（J2）侵入伸长区的根，然后在植物血管缸的分化区中迁移到植物血管缸的分化区中。其中，响应来自寄生虫的刺激，少量位于线虫头部的根细胞发展成特定的饲养结构，称为巨细​​胞[10]。

随着气候环境的迅速变化，我国栽培植物中出现新的病原菌的风险很高，因此验证新的抗性基因的功能，改善我国栽培植物的遗传基础具有非常重要的意义。植物抗性是防治根结线虫最有效的方法，特别是番茄(茄属植物lycopersicum)及胡椒(辣椒建立）。针对RKN（根结线虫）的主要抗性基因可获得[8]，其应用提供了控制RKN的安全且经济相关的策略。这些抗性（R）基因一般涉及NBS-LRR（核苷酸结合位点亮氨酸的重复）基序，并且通常位于基因组中的同时簇[12]。抗抗性基因的迟滞是辣椒育种计划的主要目的，因为这些基因中的每一个都提供对三个主要物种RKN的抵抗力m .隐姓埋名的女人那m . arenaria和m是．

本研究采用胚根、下胚轴、子叶的测定方法辣椒建立．我们的最终目标是获得一个高效的A. rhizogenes.转型系统辣椒建立品种。进一步的目标是验证和描述候选基因（我1）参与抗根结线虫的抵抗力辣椒建立．

植物材料

胡椒辣椒建立L.适用全球品种。种子表面灭菌：辣椒将种子用NaOCl（10％）灭菌15分钟，然后用双蒸馏和灭菌水漂洗。

外植体类型:用无菌叶片刮伤幼苗的胚根、下胚轴、子叶。

接种:农杆菌属rhizogenesARqua1应用与伤口表面涂层或推力的钨针(1µm小费)与植物激素和抗生素cocultivated免费Murashige &斯(MS)[13]媒体4天然后转移到MPgy (KJ女士基本为0,83毫克,50毫克NeFeEDTA, 100毫克肌醇,0 5毫克piridoxin, 0 5毫克维生素b1, 0 5毫克钠,0、5 mg IAA、10 g葡萄糖、10 g糖醛酸、10 g麦芽糖加6、5 g氧化物琼脂)生根培养基，分别加入各自选择的抗生素(卡那霉素)。

质粒构建:在转化过程中，我们使用了一个携带绿色荧光蛋白编码报告基因(GFP)的空入口载体(pK7WG2D)，以便在荧光显微镜下轻松验证转化根和卡那霉素抗性基因。

显微镜：徕卡MZ10 F立体显微镜与外部徕卡EL6000光源增强荧光成像和可视化的制造商自己的计算机软件。

在这项研究中，我们正试图为验证参与抗土壤病原体和基因的基因来验证参与土壤和形成的基因。我们的研究基于Aarrouf等人的工作。2012年，随着植物品种和接种方法的修改[14]。“毛茸茸的根”表型（图1）的发展A. rhizogenes.介导的辣椒转化子表现出纤细的丝状结构(类似于真菌中的菌丝)，特别是在切割和刺点的表面，但并不是所有的转化子都表现出毛状根表型。

另一个技术问题是，非转化根也与主根一起生长。在这种情况下，在显微镜下去除它们有助于提高转化的效率。我们使用两种接种方法成功地检测了植物根部的GFP信号(图2)。

我们得出结论，细菌的接种量证明是该方法成功的关键因素。细菌太多导致硬生根和增强的茎腐烂，同时使用过低的细菌导致马赛克变换（图3）和弱基因表达。

两种不同的接种方法表现出很大的不同效果。用细菌包覆创面的外植体转化效果较差(转化根数较低)，GFP表达较低，但易于生根。钨针的插入可以表达高水平的GFP，转化效率高，但当我们使用过多的细菌感染时，会导致植物材料损失高。由于钨针接种的转化效率和表达率较高，因此，该方法优于涂覆创面。

不同外植体的转化效率不同。子叶的转化效率最高(70%)，但由于子叶生根，植株变形，植株材料难以处理。下胚轴的转化效率高(60%)，而根的转化效率低(根产量低，GFP表达量低)，与其他两种外植体(50%)相比。我们的结果表明，下胚轴转化被证明是最有效的方法，这与Aarrouf, et al. 2012的结果一致。

该方法具有效率高、转换速度快等优点。总之，我们开发了一种高效的替代方法A. rhizogenes.介导的变换辣椒建立L.全球变化效率高于其他转化方法。

钨针感染下胚轴外植体的共转化效率最高。但是真的很难测量转换的适量的细菌与钨针,我们发现如果钨针尖端轻轻捏了一天老细菌草坪上转换效率和我们可以产生大量的植物转化的根源。

毛状根培养具有生长快、繁殖快等优点，通过无性繁殖可以实现共转化根的持续维持。这种方法基于A. rhizogenes.将支持对潜在抗抵抗基因的宿主病原体相互作用和功能分析的密集研究。在未来，我们还想验证我们的系统是否可以应用于广泛的辣椒基因型。

作者希望感谢Gyulai教授对稿件的评论。这项工作得到了人类能力部新的全国卓越计划的n-19-II-3。

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