野生型农杆菌属rhizogenes介导的基因转移在植物:农杆菌属转化株的毒力和选择

默罕默德·M Rana^1、2阿卜杜拉穆罕默德¹费迪南德L Shamalla¹和蜀魏^{1 *}

¹茶树生物学国家重点实验室和利用率、安徽农业大学、长江大街130号W合肥,安徽230036年,中国

²孟加拉国茶研究所srimangal - 3210, Moulvibazar,孟加拉国

*通信地址:蜀魏、茶树生物学国家重点实验室和利用率、安徽农业大学、长江大街130号W,合肥,安徽,230036年,中国电话和传真:+ 86-551-65783941;电子邮件:weishu@ahau.edu.cn

日期:提交:2017年5月27日;批准:09年6月2017;发表:2017年6月12

本文引用:Rana MM,阿卜杜拉M, Shamalla FL,魏野生型农杆菌属rhizogenes介导的基因转移在植物:农杆菌属转化株的毒力和选择。J植物Sci Phytopathol。2017;1:044 - 051。
DOI:10.29328 / journal.jpsp.1001005

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关键词:答:Rhizogenes;毛状根;毒性;格斯

农杆菌属介导的遗传转化是应用最广泛的方法将基因转移到植物[1]。除了便宜和简单的比最直接的基因转移方法,它减少了转基因的重排,高效整合的转基因植物基因组[2]。农杆菌属rhizogenes土壤是一种革兰氏阴性,杆状细菌[3],这是一个最合适的近亲物种农在属农杆菌属[4]。所有答:Rhizogenes菌株的特点是大根诱导的存在(Ri)质粒[5]。后答:Rhizogenes感染,毛状根的形成发生感染直接从网站的形式大量小凸像根[6];一组基因的基因组整合(编码酶参与生长素和细胞分裂素生物合成)是介导通过一个特定的转移从Ri质粒DNA(本文)[7]。答:Rhizogenes全身的根能够生长的独特属性在体外没有外源植物生长调节剂(8、9)。

毛状根培养有几个属性,促进了植物生物技术的应用程序使用。这些根也以其遗传稳定性[10]。他们的快速增长,倍增时间短,易于维护,合成一系列化合物和蛋白质的能力提供毛根部的优势植物细胞悬浮培养的连续源生产有价值的次生代谢产物和外源蛋白[4]。毛状根培养通常能够产生相同的化合物中发现野生亲本植株的根,但没有失去浓度经常观察愈伤组织或细胞悬液文化[11]。使用这些特性的答:Rhizogenes,广泛的困难在体外植物组织和器官的文化被淘汰,就可以生成与生产能力的快速增长的器官甚至更多的代谢物的浓度高于母亲植物(12、13)。

除了这个,的能力答:Rhizogenes的解除武装本文地区转移农基于二进制向量以及本文分别从Ri质粒已经利用开发co-transformed转基因毛状根文化[14]。co-transformed毛茸茸的根是一个极其强大的工具,快速和可再生的研究在各种不同的领域,包括建立基因功能[15],分析启动子活性[16],外源蛋白表达[17],抗体生产[18],修改植物代谢途径[19]和[20]功能基因组学研究。此外,复合植物可以开发[21];改变了毛茸茸的根源也可以用来产生稳定的转基因植物,那些已经被报道在一些植物包括Crotalaria [22], Medicago[23],香雪球[24]和石墨[25]。

重要的是,本文分别从Ri质粒和解除武装,本文分别从地区农基于二进制向量独立整合到植物基因组。因此,转基因植物再生从转基因毛状根培养允许隔离两本文分别在减数分裂和转基因植物行只有二进制向量导出本文分别可以获得子女后代[26]。上述优势答:Rhizogenes一个有前途的代理植物基因工程;至少对那些顽固的植物或减少响应农介导植物转换。然而,外国质粒插入野生型答:Rhizogenes压力对其毒力可能有一些影响由于转换过程中同时参与两个质粒。此外,一些其他活动也可以像本文分别从质粒或发生的任何质粒可以转移和整合到植物基因组,将导致不同的后果。因此,这个基本的研究是使用模型进行种植烟草和野生型答:Rhizogenes写明ATCC 15834株理解的影响外国质粒插入这野生型菌株,优化转化株的选择过程。

菌株和转换向量

本研究中使用的二进制向量pBI121从Clontech购买(中国,北京)。矢量控制gusA和《不扩散核武器条约》二世,作为记者和选择性基因,分别。大肠杆菌应变DH5α用于扩大规模小的质粒pBI121。农杆菌属rhizogenes写明ATCC 15834菌株用于转换的研究。菌株都是263年从实验室获得,满足茶树生物学重点实验室和利用率、安徽农业大学、安徽、合肥,中国。

细菌转化

二进制向量pBI121首次引入大肠杆菌应变DH5α标准协议后放大规模小的质粒。然后提取质粒大肠杆菌最后引入农杆菌属后热休克方法。成功的转变农杆菌属通过PCR证实。PCR, 1μL细菌培养是用作每个模板反应混合物(25μL)。积极的和消极的控制由1μL质粒DNA (∼50 ng)和1μL ddH2O,分别。35 s的引物序列(向前),5′-caatcccactatccttcg caagaccc-3′和NOS(反向),5′-GATCTAGTAACATAGATGAC ACCG-3′是用于扩增片段长度pBI121的2239个基点。PCR进行25μL反应体积包含Easy-Taq 1单位的DNA聚合酶,1μL细菌培养,每个引物(10毫米μL·L¹),2.5μL10×缓冲区,2μL核苷酸(2.5毫米·L¹),17.5μL水。放大了在一个可编程的热循环(Bio-Rad S1000)如下:最初的变性在95°C 5分钟,30周期放大(变性在95°C 30年代,退火55°C 30年代,在72°C和扩展2分钟30年代)和最后一个扩展的10分钟72°C。放大后,样本解决DNA凝胶电泳(图1)。最后,验证积极农杆菌属(转换pBI121)文化被保留在-80°C为进一步使用。

烟草转换

比较毒性的改变答:Rhizogenes与野生型,检查转换的能力农杆菌属转移和二进制向量本文集成到植物基因组中,烟草叶片外植体转换进行了实验。烟叶外植体接种分别使用野生型和转换农杆菌属。毛状根代转化的效率农杆菌属也测试了不同选择性压力下(即不同浓度的抗生素卡那霉素)。总之,治疗方法包括:野生型(T0)农杆菌属+ 0 mg·L¹卡那霉素;(T1)转换农杆菌属+ 0 mg·L¹卡那霉素;(T2)转换农杆菌属+ 12.5 mg·L¹卡那霉素;(T3)转换农杆菌属+ 25.0 mg·L¹卡那霉素;(T4)转换农杆菌属+ 37.5 mg·L¹卡那霉素(T5)转变农杆菌属+ 50.0 mg·L¹卡那霉素。

实验设计

实验是在一个完全随机设计有三个复制。每个复制由一个包含10个培养皿¹5叶外植体。

准备的媒体

本研究中使用的半歇工媒体女士固化为6.5 g·L¹琼脂和pH值调整到5.7在121°C高压灭菌法之前20分钟。抗生素filter-sterilized热压处理过的媒体时,冷却到约50°C。

农杆菌属烟草叶片外植体接种和感应毛茸茸的根源

毛在烟草叶片外植体的诱导,啤酒文化的转换答:Rhizogenes制备LB培养基中含有抗生素利福平和卡那霉素(无论是在50 mg·L¹)。农杆菌属文化是发展到一个OD_600年值约为0.6。细胞被颗粒状在2100×g离心10分钟,和颗粒在液体培养基中女士re-suspended最终OD_600年接种前值为0.6。

年轻的烟叶的切除在体外植株生长和浸泡在液体媒体女士(4.4 g·L¹盐,女士30 g·L¹蔗糖、pH5.7)无菌培养皿中避免de-hydration。树叶首次穿刺在几个地方使用无菌手术刀来促进农杆菌属感染,然后切成8×10毫米矩形块放入液体女士媒体在培养皿中。外植体沉入水中农杆菌属文化5分钟。接种叶块涂抹在无菌滤纸去除多余农杆菌属女士,然后镀半歇工媒体补充30 g·L¹在黑暗中蔗糖为co-cultivation (25°C 2天)。co-cultivation之后,叶外植体用无菌蒸馏水冲洗2次删除农杆菌属女士,然后进行一个额外的冲洗液体含有500 mg·L¹羧苄青霉素。后来,外植体涂抹在滤纸,镀(近轴的一侧,10¹5外植体·板¹)媒体与不同浓度卡那霉素结合300 mg·L¹羧苄青霉素。培养皿和一条封口膜密封覆盖。文化是孵化25±1°C, 16小时光周期对毛根部的一代。非转换的野生型农杆菌属被用来控制,在这种情况下,没有卡那霉素用于各自的培养。

数据收集

培养4周后,个人毛状根线路从每个外植体通过破坏性抽样统计。平均数据从所有外植体在一个盘子一个复制的数据表示。以这种方式收集数据复制的所有治疗。在这项研究中,治疗比较通过确定平均每个外植体产生的毛状根线数(即毛根·外植体¹)。

β-glucuronidase(格斯)表达在毛茸茸的根源分析

组织化学试验的gusA基因表达进行了如前所述,杰弗逊等。[27]。总之,毛状根外植体的分离,淹没到GUS染色溶液(1毫米X-Gluc 50 mm磷酸盐缓冲剂10毫米EDTA,和0.1% Triton x¹00)和孵化12 h在37°C。外植体被浸泡在70%乙醇和蓝色发展研究。

毛状根代结果表示为均值±标准差(SD)。使用方差分析的数据进行分析,统计差异意味着比较通过邓肯的多个测试范围(DMRT),使用统计软件包MSTAT [28]。

野生型转变答:Rhizogenes

几次之后,二进制向量pBI121成功引入氯化钙主管答:RhizogenesATCC15834通过热休克方法,证实了PCR和凝胶电泳。

比较野生型和转换效率农杆菌属在毛状根的一代

为了比较野生型的转化效率和转换答:Rhizogenes,野生型和改变农杆菌属被用来从烟草叶片外植体产生的根源。毛根部大约9天的接种后开始出现。大约四个星期的接种后,毛根部几乎覆盖所有的外植体在T0(图2)。结果表明,野生型答:RhizogenesATCC15834与第二个质粒转化(pBI121),其毒性显著降低(p< 0.01),显示6.95±0.76毛根·外植体¹在T1 T0相比野生型农杆菌属生成12.70±1.41毛根·外植体¹(图2和3)。这表明本文分别从Ri质粒转移是影响第二个质粒的存在和决心的原因需要进一步的研究。

选择压力下毛状根生成效率

观察毛状根代转化的效率农杆菌属不同的选择压力下,不同浓度卡那霉素是用于选择的媒体。这是观察到的毛根部逐渐随浓度的增加而降低选择代理卡那霉素显著(图2)。(p< 0.01)高毛每根外植体(6.95±0.76)获得T1时没有使用卡那霉素(图2和3)。这是紧随其后的是4.94±0.49毛根·外植体¹在T2 (12.5 mg·L¹卡那霉素),2.86±0.80毛根·外植体¹在T3 (25 mg·L¹卡那霉素),1.83±0.39毛根·外植体¹在T4 (37.5 mg·L¹卡那霉素),最低为0.753±0.150毛根·外植体¹在T5 (50 mg·L¹卡那霉素)。然而,之间的效率差异T3和T4, T4和T5之间没有统计学意义(p > 0.05)。总的来说,本文的Ri质粒转移到植物细胞并集成到基因组,毛状根应该是只有转化细胞的生成。如果相同的细胞也将与耐药基因同时从二进制向量,然后co-transformed细胞能够产生毛在选择压力下根。结果显示显著降低毛起源于T2-T5选择压力下相比,在T1没有选择压力,表明共转化可能并不总是发生。起重机等。[23],也报道称,并不是所有的毛茸茸的根是互相转化事件的结果。科利尔et al .[29],报道称,20至60%的毛根部产生芽接种野生型答:Rhizogenes包含一个二进制质粒将包含hairy-root-inducing和二进制本文。考虑这些,生成的多毛的根部被检测GUS表达筛选基因组整合本文分别从pBI121向量。有些毛根显示高度变量(很弱到强)GUS表达整个根(图4);一些显示非常低的水平只有根尖,和其他人没有任何表情,即使在变量选择压力。可能的原因是,植物转换并不总是导致有效的转基因表达由于本文整合到植物基因组的转录沉默区域[30]。这些结果表明,荧光标记可能是一个更好的选择替代抗生素的选择,这似乎更可靠的比卡那霉素抗性筛选转基因毛状根在转基因有效表达。

在这项研究中,野生型答:Rhizogenes写明ATCC 15834年与二进制向量pBI121成功地改变了,但与野生型相比,改变了农杆菌属显示减少毒性。毛状根代转化的效率农杆菌属是媒体没有任何卡那霉素最高和最低50 mg·L¹卡那霉素。有些毛根显示GUS表达,证实了基因转录活性本文的整合,虽然这并非总是如此。本研究的结果也表明,荧光标记可能是一个更好的选择抗生素的选择,这似乎更可靠的比卡那霉素抗性筛选高效的转基因表达的转基因毛状根。

作者表达自己的感谢刘晶晶,为实验提供野生型烟草幼苗。