作品简介:Sodium-glucose转运蛋白2抑制剂如empagliflozin(电子探针)预防糖尿病肾病。前列腺素E2(铂族元素₂)主肾cyclooxygenase-2的产物,抑制血管加压素(AVP)——集合管的重吸收(CD)。本研究的新颖性是第一次,我们检查如果电子探针影响肾铂族元素₂CD / EP受体系统和确定如果应对电子探针防止水分流失。

方法:四组的成年雄性小鼠治疗6周后进行了研究:控制(db /米),db / m +电子探针(chow 10毫克/公斤/天),2型糖尿病患者糖尿病/血脂异常(db / db)和db / db +电子探针。小管被microdissected定量聚合酶链反应(qPCR)和CD水运测量avon,有或没有铂族元素₂。

结果:通过电子探针高血糖和蛋白尿是衰减的。肾mRNA表达COX,铂族元素合成酶,铂族元素₂(EP)受体亚型,CD avon V2受体和aquaporin-2高架在db / db的老鼠,但通过电子探针不变。尿液铂族元素₂水平增加了电子探针在db / db但持平。AVP-water再吸收相当在db / db / m +电子探针,同样由铂族元素减到50%₂。在db / db老鼠,AVP-water再吸收非糖尿病老鼠相比降低了50%,这减少了影响电子探针。在db / db老鼠,AVP-stimulated水运与铂族元素更重要的是减毒₂(62%),与非糖尿病小鼠相比,但这衰减降低电子探针,至28%。

结论:总之,肾脏铂族元素的表情₂在db / db / EP受体增加老鼠,这表情是影响电子探针。然而,在糖尿病的CD,铂族元素₂引起了更大的衰减AVP-stimulated水重吸收,这种衰减减少电子探针。这表明,电子探针变弱diabetes-induced过剩CD失水。

糖尿病是慢性肾脏疾病(CKD)的主要原因,并已达到流行病的地位。在最新anti-hyperglycemic代理,sodium-glucose转运蛋白2 (SGLT2)抑制剂如empagliflozin(电子探针)是有前景的治疗,因为他们不仅降低血糖,抑制近端小管葡萄糖吸收,而且可以减少不良代谢、心血管和肾脏结果[1]。SGLT2抑制剂减少肾小球反渗透法和人类糖尿病肾病蛋白尿(DKD) [2 - 4]。尽管糖尿病这些承诺的好处,主要影响肾脏的内分泌系统和小管传输函数是未知的。

铂族元素₂的主要肾产品环氧酶2 (COX2),肾小球血流动力学的关键调节器和肾素分泌,以及沿肾元钠和水运输。铂族元素₂作用于4 G protein-coupled EP受体(EP_{1 - 4}),收集管中大量表达(CD)。我们组和其他人表明,铂族元素₂刺激和水钠重吸收通过EP的CD₄;并通过EP促进尿钠排泄和利尿₁和EP₃得罪血管加压素(AVP)介导的水重吸收[5 - 7]。

总的来说,EP₁和EP₃受体激活的铂族元素₂导致肾单位功能障碍和伤害在1型糖尿病(5、6)。我们和其他人的研究表明,酶介导肾铂族元素的综合₂(COX2和微粒体铂族元素₂合酶1)在1型啮齿动物和人类DKD升高,尿铂族元素也一样₂水平[8]。在1型糖尿病模型,我们表明,肾EP₁促进肾小球滤过屏障和肾小管损伤,导致反渗透法和蛋白尿,而基因删除EP₁删除是有益的[12]。我们还表明,肾EP₃导致多尿症,影响糖尿病大鼠尿浓缩功能[13]。然而,肾铂族元素的作用₂/ EP受体与2型糖尿病肾病相关还不清楚。

本研究的目的是检查电子探针CD对铂族元素的反应的影响₂2型糖尿病小鼠(db / db)。虽然电子探针nephroprotective在2型糖尿病,增加葡萄糖的影响和流体沿肾元交付没有详细研究。因此,我们还研究了电子探针如何影响肾铂族元素₂/ EP受体系统,CD的内分泌系统如何应对电子探针,以防止过多的水分流失。

2型糖尿病小鼠和电子探针治疗

男性(BKS.Cg - db / db老鼠Dock7^米+ / +Lepr^db/ J;杰克逊实验室)及其控制杂合的(db /米)同窝出生的老鼠,12 wks-old的时代,进行了研究。我们小鼠随机分为4组:控制(db / m), db / m +电子探针,2型糖尿病(db / db), db / db +电子探针和empagliflozin管理(电子探针;10毫克/公斤/天;德国勃林格殷格翰集团)在标准粮(由Envigo实验室)。10毫克/公斤/天的剂量选择6周内根据先前的啮齿动物研究[14]。老鼠被安置在一个12-hr光暗周期,免费获取标准的食物和水。老鼠被放血牺牲下异氟烷麻醉。所有动物程序进行渥太华大学动物保健和兽医服务植物园和渥太华大学动物保健委员会批准。

鼠标特点、血压和尿分析

电子探针在各种新陈代谢和肾功能的影响参数,测量体重和血糖。肾脏重量是体重正常。现货尿液收集每天在同一时间。进食和饮水,尿量每天监测连续3天的适应一天24小时代谢笼。尿液分析参数包括白蛋白通过ELISA(美国TX Bethyl实验室)、铂族元素₂化学水平ELISA(开曼),同渗重摩的冰点降低(先进模型3莫+渗压计,先进的仪器公司,妈,美国)。肌酐值归一化(Exocell Inc)。

测定肾小球滤过率(GFR)

肾小球滤过率(GFR)被FITC-inulin间隙以有意识的老鼠。简单,5% FITC-inulin (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)溶解在0.9%盐透析过夜,过滤。老鼠注射3.74µl / g BW FITC-inulin通过尾静脉。从隐静脉血液收集到毛细管肝素化后3、7、10、15岁,35岁,55和75分钟,离心机。样品缓冲在玫瑰(500毫米,pH7.4)和荧光测量(励磁488海里/发射538海里)。肾小球滤过率(GFR)使用两舱制间隙计算模型之前报道[15]。

定量PCR分析

检查肾铂族元素的表达₂/ EP受体系统、水和溶质转运蛋白在肾元,我们进行了定量PCR (qPCR)。左侧肾脏解剖分离皮层和髓质和microdissected小管(提升肢体近端小管,厚,皮层和髓内CD),然后在液氮snap-frozen。组织均质使用tp - 103合并者COE Capmixer(美国GC美国公司,IL)。RNA从microdissected小管后得到RNAqueous迷你包(美国马英杰公司)根据制造商的协议。组织RNA分离试剂盒(表达载体、马、美国)。RNA样本DNAse对待我(表达载体、马、美国)。信使rna被qPCR ABI棱镜7000测量系统使用特定的引物(表1),和SYBR优势qPCR预混料(Clontech实验室、CA、美国)根据制造商的指示。我们测量铂族元素的表达₂合成的酶(微粒体铂族元素₂合酶:mPGES-1 mPGES-2,胞质铂族元素₂合酶:cpg, COX1 COX2)和EP_{1 - 4}由qPCR受体。表达式是18 s RNA和2 lepr规范化^-ΔΔCT方法用于分析完成以前[15]。

体外microperfusion收集管道和水运输

电子探针已经是一个众所周知的抗糖尿病药物治疗2型糖尿病,但没有什么是已知的关于电子探针如何影响肾膜运输在db / db老鼠。小鼠安乐死后6周内电子探针,从右肾脏被microdissected IMCD在体外microperfusions和测量净液再吸收(合资企业)。³H-inulin(75µCi /毫升)被用作卷标记。在控制时期,两个集合为基础计算企业30分钟后到达平衡。小管与消极的基底合资丢弃。AVP (10^-12年毫米,Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)添加到浴和四个10分钟集合。铂族元素₂(10⁷毫米,Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)然后添加五个额外的10分钟集合。意味着企业计算如前所述(15)。成分的浴、解剖和灌注方案发表[16]。对糖尿病灌注,葡萄糖是增加8.3至25毫米的正常洗澡。控制渗透反应对照组与16.7甘露醇+ 8.3毫米葡萄糖灌注。灌流液低渗的在290年vs。440 mOsm浴。

统计分析

Graphpad棱镜(美国圣地亚哥,CA)是用于数据分析。值表示为±SEM手段。统计分析是用单向方差分析图基的文章以及紧随其后。意义是表示p< 0.05。此外,一个样本t检验的假设值1是qPCR执行。

生理参数、血压和肾小球滤过率(GFR)

研究2型糖尿病和电子探针对老鼠的影响生理和肾功能,我们第一次测量食物和水的摄入量,体重和血糖。如图1所示,食物和水的摄入量,身体重量,血糖升高在db / db db / dm小鼠相比。电子探针对食物和水的摄入量没有影响或体重,但显著降低血糖水平相比db / db老鼠。

在图2中,FITC-inulin间隙增加了500 ul /分钟在db / db老鼠相比在db / m 300 ul /分钟,但只有在db / db +电子探针相比略低db / db。尿液铂族元素₂水平高10倍在db / db / db老鼠相比,m,但通过电子探针(图2 b)不变。

尿液同渗重摩在db / db小鼠减少50%相比,db / m,而且不受电子探针(图2)。然而,尿白蛋白水平在db / db老鼠和增加三倍降至接近控制水平通过电子探针(图2 d)。

肾环氧酶的表达,铂族元素₂合成酶和EP受体

判断肾铂族元素₂/ EP受体系统改变对电子探针在2型糖尿病或反应,我们为铂族元素的区域和节段mRNA表达谱₂途径,包括合成的酶:COX1 COX2和铂族元素₂合成酶(微粒体mPGES1、mPGES2和胞质cpg),以及四个EP受体(EP_{1 - 4})。

如图3所示,皮质COX-1 mRNA相比降低了50%在所有组db / m,包括db / m +电子探针。电子探针没有进一步降低COX1 db / db老鼠。髓COX1 mRNA在db / db小鼠显著增加,但通过电子探针(图3 b)不变。相比之下,COX2 mRNA的皮质和髓质增加db / db老鼠的2.6倍和3.5倍,分别与db / m;虽然这不是明显的髓质(p= 0.06)。水平相似的db / db和db / db +电子探针(图3 c和3 d)。髓mPGES1信使rna也增加在db / db / db老鼠相比,m,并通过电子探针不变(图4 a, B)。然而,在髓质mPGES1也增加在db / m +电子探针(图4 b)相比,db / m。肾脏的表达mPGES2(图4 c, D)和cpg相似组(数据未显示)。

EP受体表达以microdissected近端小管(PT),提升肢(TAL)厚,皮层和髓内CD (CCD和IMCD分别)。如图5 c + D, EP₁CCD mRNA增加2倍(p< 0.05)在db / db / db老鼠相比,m,但影响电子探针。EP₁信使rna在db / db PT和TAL和减少影响电子探针,但是EP₁也减少了75%的PT db / m +电子探针和db / db(图5 a, B)。EP₃表达显著减少50%的TAL db / db +电子探针相比,db / m(图5),否则不变。EP₄没有检测到microdissected TAL和CCD。在工党,EP₄信使rna在所有组降低75%以上,几乎检测不到db / m +电子探针和db / db db / m(图5)。EP₄也减少50%相比,db / m +电子探针IMCD db / m,但在db / db不变和db / db +电子探针(图5 j)。EP2在糖尿病大鼠皮质和髓质中不变,影响电子探针,检测不到微切割小管(数据没有显示)。

肾钠转运蛋白的表达

我们检查了mRNA的表达主要钠转运蛋白在肾皮质和microdissected小管部分。如图6 a、B的皮质表达氢钠换热器(新人道)3和上皮细胞钠离子通道(αENaC)分别增加2倍和1.8倍在db / db / db老鼠相比,m,但影响电子探针。相比之下,皮质sodium-potassium-ATPase降低了40% - 50%所有组相比,db / m,虽然并没有显著减少在db / db +电子探针(图6)。

接下来,我们显示在microdissected PT钠葡萄糖转运蛋白SGLT1 mRNA降低了50%在db / db / m +电子探针相比,m,但没有改变糖尿病小管(图6 d)。SGLT2 mRNA然而相当在所有组(图6 e)。有趣的是,TAL sodium-potassium-2-chloride转运蛋白(NKCC2) mRNA增加2倍在db / m +电子探针和db / db小管相比,db / m,但返回的表达式来控制水平在db / db +电子探针(图6)。

CD水通道蛋白的表达、avon V2受体和尿素运输车

我们接下来检查mRNA表达的皮质和髓水通道蛋白(AQP) 1和AQP2,两个主要的肾水通道。如图7所示,皮质AQP1在db / db增加2.5倍+电子探针和db / m相比,和其他两组不变(图7)。AQP1在db / db不变这两个地区的老鼠。相比之下,AQP2分别增加了4倍和2倍的皮质和髓质db / db老鼠相比,db / m(图7 c, D),然而这种增长是通过电子探针一成不变的。AQP2持平在db / m +电子探针的皮质和髓质。

我们还研究了AVP V2受体的表达(V2R) microdissected皮质和髓内CD (CCD和IMCD)。如图8所示,CCD V2R mRNA增加三倍在db / db / db老鼠相比,m。此外,髓V2R mRNA表达增加2.5折在db / db和db / db +电子探针相比,db / m(图8 b)。我们还研究了尿素的mRNA表达transporterA1 (UTA1)收集管道。如图8 c, UTA1表达增加8折在db / db +电子探针和db / m相比,并没有表现在其他两组。

收集管水运输

进行了功能性研究包括IMCD确定水重吸收增加,以弥补渗透性利尿引起电子探针。我们工作首先决定是否改变基底水通量在db / db老鼠,然后电子探针如何改变基底水运。接下来,我们评估水通量10,⁸M AVP和AVP + 10⁷米铂族元素₂。如图9所示,AVP-stimulated水重吸收相当在db / db / m +电子探针在5问/毫米/分钟,同样减45和46%铂族元素₂。在db / db老鼠,AVP响应降低了50%,并减少由电子探针不受影响。有一个更大的衰减AVP-mediated水运在db / db应对铂族元素₂62%,但这种衰减降低电子探针,在db / db +电子探针的28%。

四组的成年雄性小鼠治疗6周后进行了研究:控制(db /米),db / m +电子探针(chow 10毫克/公斤/天),2型糖尿病(db / db)和db / db +电子探针。小管被microdissected qPCR水分传输和CD以应对avon,有或没有铂族元素₂。通过电子探针高血糖和蛋白尿是衰减的。肾mRNA表达COX,铂族元素合酶,EP受体,CD avon V2受体和aquapoSSSSSrin-2高架在db / db的老鼠,但通过电子探针不变。尿液铂族元素₂水平增加了电子探针在db / db但持平。AVP-water再吸收相当在db / db / m +电子探针,同样由铂族元素减到50%₂。在db / db老鼠,AVP-water再吸收非糖尿病老鼠相比降低了50%,这减少了影响电子探针。在db / db老鼠,AVP-stimulated水运与铂族元素更重要的是减毒₂(62%),与非糖尿病小鼠相比,但这衰减降低电子探针,至28%。

除了经典的扰动与DKD的发病机理,即改变血流动力学和滤过屏障功能障碍,近端小管运输和伤害也参与肾脏疾病的发生和发展[19]。SGLT2转运蛋白重吸收90%以上的过滤中升高血糖和糖尿病近端小管,导致高血糖[20]。SGLT2现在被认为是一个关键的目标anti-hyperglycemic治疗[21]。事实上,Jurczak[22]检查SGLT2基因的影响(SLC5A2)删除小鼠胰腺db / db,其他器官,代谢和肾的结果有所改善,但糖尿病肾单位的交通特性研究。的主要小说找到我们的研究是收集管补偿利尿电子探针,通过增加终端IMCD水重吸收。铂族元素₂有牵连在这反应,自AVP-mediated水重吸收衰减在db / db显著降低小鼠接受电子探针相比,非糖尿病老鼠。

SGLT2抑制后,小管远端肾单位将暴露增加溶质和水的交付。防止过多的水损失,CD必须适应并增加水的重吸收。我们最近报道了铂族元素的一个关键的角色₂/ EP₁在老鼠衰减CD AVP-mediated水运[15]。我们的数据表明,减少EP₁介导衰减avon运输可能构成我们观察到的减少。另一种可能性是AVP-independent水重吸收增加了CD。高,等。[24]报道CD铂族元素的重要作用₂/ EP₄在AVP-independent水重吸收。在我们的老鼠,6周内的电子探针后,体积状态维护尽管近端小管重吸收减少,表明补偿发生近端小管的下游。很有可能发生上述机制的结合,以确保最佳的补偿。

SGLT2抑制剂减少肾小球人类DKD反渗透法和蛋白尿[2,3]。虽然反渗透法可能减毒在糖尿病患者中,肾小球滤过率(GFR)最终趋于正常,这是承诺的这些药物的治疗作用CKD患者的风险已经降低肾过滤功能(2,23)。在我们的研究中,db / db老鼠hyperfiltering,但电子探针对肾小球滤过率(GFR)没有影响。然而,我们观察到显著降低蛋白尿与降低高血糖相伴,但独立的肾小球滤过率(GFR)的变化。减少蛋白尿的机制没有探索,值得进一步研究。最近的工作在啮齿动物中强调了积极的肾成果与SGLT2抑制2型糖尿病相关,治疗16周内[1,25日,26日]。肾的好处后,并未观察到与canagliflozin SGLT2抑制1型糖尿病以挪士基因敲除小鼠[28],然而在1型秋田老鼠反渗透法和蛋白尿都提高了电子探针[29]。然而,有益结果不一致甚至在2型糖尿病小鼠db / db。盖洛,例如,在研究et al。[27],肾纤维化的分子标记在db / db改善小鼠后10周内的电子探针,没有减少蛋白尿或防止肾脏损伤。也许后再治疗,改善肾反渗透法更有可能在我们的研究中,我们观察到显著改善蛋白尿的肾小球滤过率(GFR)的变化。 The reason for the discrepancy in all these rodent studies is unclear, but drug class, timing, and dose may be important factors, and in previous reports EMPA treatment was prolonged up to 16 wks. More work is needed to fully understand the mechanisms underlying the benefits of EMPA, since in our study they are clearly not associated with improvements in hyperglycemia or hyperfiltration.

总的来说,铂族元素₂促进利尿和尿钠排泄,EP₁和EP₃通过EP,促进水的重吸收₄。所有三个亚型已本地化的近端小管,TAL,由我们组和CD,和他们的表达在血压正常的人相比,高血压老鼠[15]。这里显示的模式表达db / db EP受体的老鼠肾脏及其杂合的控制。我们所知,这是第一个描述在2型糖尿病肾EP受体的表达。最值得注意的发现本研究肾EP₁和EP₃主要是增加2型,因为它们是在1型糖尿病(6、8),和EP吗₄是减少的。信使rna的增加可能会作为一个反馈响应降低EP受体蛋白表达。表达谱取决于肾元段,在我们之前的研究中我们发现,PT EP受体表达减少在糖尿病。这种减少的意义还有待研究。我们此前报道称,铂族元素₂起刺激作用在PT水运[30],但很少有人了解其他PT运输过程与每个EP受体亚型。感兴趣的,我们也观察到分子钠转运蛋白和水通道蛋白的表达变化在电子探针治疗小鼠糖尿病的独立状态,即PT SGLT1, TAL NKCC2, CD水通道蛋白1和2。目前尚不清楚mRNA表达模式的结果从反馈的响应或补偿性反应的结果保存钠和水,防止过多的损失。

完全我们的工作强调需要全面调查运输后肾单位的反应近端小管SGLT2抑制,特别是这些抑制剂已经成为治疗的核心部分阿森纳降低高血糖和预防心血管和肾脏并发症与2型糖尿病有关。铂族元素也就不足为奇了₂/ EP受体系统响应电子探针治疗以防止过多的水分损失。毕竟人们早就认识到,铂族元素₂和AVP关键激素水平衡的微调,尤其是在糖尿病,但更当肾元进一步挑战增加溶质和水的交付。电子探针治疗远端肾单位运输的长期后果值得进一步调查。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

金融支持

这项研究是由加拿大从肾脏基金会的资助(批准号152092)。

作者的贡献

RN最初手稿写道。RN,生理改变、VC和JFT实验程序执行。JFT, KDB RLH修订后的手稿。

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