精子DNA片段对ICSI结果的影响:一项前瞻性研究

目的和目标:主要目的是测量精子DNA损伤并研究精子DNA损伤的程度。次要目的是研究精子DNA片段对第5天囊胚膨大的影响(分级为1-5)。

结果:随着年龄的增长，精子DNA碎片也会增加。精子DNA碎片的增加也与精液样本中异常的运动和形态有关。然而，胚泡的扩张或级别没有降低。

结论:精子DNA碎片检测对不明原因的不育症是一项有用的研究。然而，精子DNA片段与ICSI周期中第5天胚胎分级无显著相关性。

生殖医学奖学金学生Ramya Harish博士的论文工作

传统上按照世界卫生组织2010年进行的精液分析包括精子体积、液化时间、精液pH值、精子浓度、精子形态、精液果糖、精子活力和精液活性氧(ROS)。世卫组织1999年指南还分析了精子凝集试验和白细胞浓度。这些实验室测试揭示了人类精子的形态和功能，但这些分析可能无法揭示精子DNA的缺陷[1-3]。有趣的是，只有15%的不育男性的精液分析符合世卫组织指导方针[4]。精子DNA损伤是否会对自然受孕和辅助受孕的生殖结果产生不利影响，这是一个有争议的问题。少数研究表明，未成熟的核蛋白和精子DNA单链和双链断裂可导致植入失败，临床妊娠率较低和早期流产[4]。最近，一些旨在改善传统ICSI精子选择的技术已被证明可以提高受精率，提高成功受精后的胚胎质量，并优化妊娠率。DNA损伤可能以单链断裂或双链断裂的形式发生，这两种类型都可以通过不同的方法进行分析和或量化。这些是精子染色质分散试验(SCDT)，精子染色质结构试验(SCSA)，脱氧核苷酸转移介导的dUTP裂孔末端标记试验(TUNEL)和单细胞凝胶电泳试验(COMET)[5,6]。精原细胞发育为初级精子细胞，再发育为次级精子细胞，次级精子细胞脱落细胞质形成精子。 DNA in spermatogonia is mainly histone bound and protamination of DNA takes place in testicular seminiferous tubules. During the process of sperm DNA maturation histones are replaced by protamine that are half the size of histones. In the mature spermatozoon nucleoprotein, 85% of mature sperm DNA is bound to protamine I and II and 15% of sperm DNA is bound to histones [7,8]. If histones are bound to > 15% of DNA it is termed as immature nucleoprotein and it has been postulated by a few studies as the most likely etiology of sperm DNA defects. The other etiological factors are varicocele, increased testicular temperature, stress, aging, increased BMI (Body Mass Index), smoking, and infrequent ejaculation [9,10]. Other factors are environmental pollution, male genital tract infections, toxins, radiation exposure, diabetes, testicular cancers and abuse of recreational drugs and caffeine. The biological mechanisms involved are defective protamination, increased apoptosis and oxidative stress. Defective protamination happens in the testes. Oxidative stress mostly happens as a result of sperm motility and metabolism while transit through the epididymis [11,12]. Apoptotic stress can happen either in testes or in the epididymis. Presence of leukocytes and immature sperm also add to the oxidative stress. Oxidative stress is sometimes also due to low antioxidants in the seminal plasma[13,14].

精子的获能、顶体反应、超活化和卵母细胞融合都需要适度的精子氧化，但过高的氧化量可能导致精子DNA损伤。精子DNA片段检测可用于不明原因不孕、复发性植入失败、复发性流产、年龄> 40岁、精索静脉曲张、胚胎压密期代谢阻滞的诊断。在人类胚胎中，基因组依赖于卵母细胞，直到第3天之后，胚胎基因组被激活。胚胎基因组的激活是一个复杂的过程。胚胎基因组激活失败会导致胚胎在第3天的代谢受阻。因此，本研究的主要目的是确定精子DNA片段检测在低生育能力夫妇中的作用，并将其与其他传统精子分析参数相关联。次要目的是将精子DNA片段与胚胎滋养外胚层和内部细胞质量特征联系起来。

这是在Saveetha医学院和ARC不孕不育医院的妇产科进行的一项前瞻性观察研究。研究方案通过，收集的所有数据经机构伦理委员会和审查委员会审核批准。所有参与者夫妇均获得当地语言的知情书面同意。本研究的目的是探讨精子DNA片段在ICSI中的作用。60对夫妇(原发性或继发性不孕)在一年内被纳入研究。

精液中精子浓度至少为1 × 106/ml的男性伴侣也包括在内。排除有已知妇科病理(如已知子宫内膜异位症、肌瘤和任何妇科器官的手术)的夫妇。新鲜胚胎移植周期和供体卵母细胞受体也被排除在研究之外。

在不育诊所接受SCD(精子染色质分散)方法进行精子DNA碎片检测的男性伴侣的知情书面同意。在禁欲2-5天后用手淫采集精液样本。精液被允许液化。采用SCD法(halo view, DNA片段检测试剂盒)对DNA片段进行检测。在测试前，精子浓度被稀释到5-10万每毫升(用含有HEPES,HTF和HSF的试管v -精子洗涤液稀释)。如果精子浓度低于500万/ml，则将精液样本离心，并使用颗粒进行染色质分散试验。

精子染色质分散试验方案有5个步骤

第一步:试剂准备:在第一步中，将所有试剂置于室温下，从浓缩的原液中制备出吉氏菌的工作溶液。吉姆萨工作液是加入吉姆萨原液与磷酸盐缓冲盐水和蒸馏水(1:1:1)制成的。

第二步:样品制备:琼脂糖凝胶在90度水浴中融化5分钟。琼脂糖凝胶现在放在37度的水浴中，让它平衡。将精液样本加入到融合的琼脂中。立即将精液琼脂糖混合物移出，在玻片上涂片并放置盖片。现在，将载玻片置于4度下5分钟，以产生嵌有精子细胞的微凝胶。

步骤3：变性和溶解：在这一步中，轻轻取下盖玻片，并用酸变性溶液覆盖精子琼脂糖涂片7分钟。之后，用裂解缓冲液覆盖精子琼脂糖涂片25分钟。现在用大量蒸馏水冲洗玻片5分钟。

步骤4：固定和染色：现在将涂片依次加入70%酒精，90%酒精，100%酒精，每次2分钟，然后风干，逐渐脱水。固定好Giemsa工作溶液后，覆盖5-10分钟，使涂片染色。强烈的染色是首选的，以实现容易可视化的周围分散的DNA环晕。

第五步:观察和解释:载玻片在40倍亮场照明下观察。根据费尔南德斯等人建立的模式，至少有200个精子被计数和评分。精子DNA碎片率(DFI%)按精子DNA碎片率/总精子数计算。表1给出了光环大小和精子DNA碎片的解释。采用密度梯度法进行单精子注射。当DNA片段率超过30%时进行磁辅助细胞分选。采用常规ICSI，用离体生物单步培养基培养至第5天。

记录年龄、活力和形态、精子DNA片段和第5天胚胎等级（根据囊胚的扩张、内细胞质量和滋养体表皮形态分级1-5）。

统计分析

对数据进行了分析，并进行了图形记录。采用描述性和推理统计学方法分析数据。年龄、精子数、精子活力和精子形态的比较，采用卡尔皮尔逊相关系数(r)测量两个变量的线性相关性。相关系数，-1 <= r <= 1,1表示强正相关，-1表示强负相关，0表示不相关。使用笛卡尔坐标绘制散点图以显示两个变量的值。分类变量分析采用带Yate校正的卡方检验。使用MEDCALC(比利时)的统计软件进行统计分析。

参与者的平均年龄为35.83 + 4.81。结果发现，随着年龄的增长，精子数量不受影响，但活力和形态受到影响。随着年龄的增长，精子DNA碎片增多。DNA片段与精子活力之间无显著正相关。碎片和形态之间也观察到不显著的负相关。表2总结了人口统计学变量与精液参数之间的相关性。精子DNA碎裂也对囊胚膨胀没有影响(表3)。精子DNA碎裂超过30%也与滋养外胚层或内部细胞质量等级无关(表4、5)。

与体细胞和卵母细胞中的组蛋白不同，精子DNA在环状体中含有过渡核蛋白(TNPs)和精蛋白[15-17]。图1阐述了核蛋白成熟过程中精子DNA染色质的排列和组蛋白被精蛋白取代。最常见的缺陷是单链和双链DNA断裂。其他缺陷是碱基删除和碱基修改。此外，还可以有链间和链内交叉链接(图2)。

protamination过程有几个优点(a) DNA冷凝的结果在一个较轻的原子核容易提升精子进入女性生殖道(b)增强DNA稳定自由基生成的精浆由于精子能动性和新陈代谢(c)体细胞表观遗传基因的精子核启用合配后卵母细胞的自由重编程(d)精子发生中的一个检查点(受精缺陷可作为凋亡途径开始的检查点)(e)受精后卵母细胞的激活[18,19]。图3a-c详细阐述了胚胎分级系统(Gardener和Schoolcraft)。

鱼精蛋白化过程有时可能与受损的DNA有关。DNA断裂是人类精子凋亡的标志，可能由异常的核酸内切酶活性引起，并由质膜蛋白Fas介导。先前的研究表明，不育男性精液中的凋亡增加。凋亡是在精子形态异常的样本中也会增加[10]。与其他研究一致，本研究还表明，随着年龄的增长，精子DNA断裂增加。图4显示了染色后的精子晕试验。

虹鳟卵母细胞和胚胎的最新研究证明，卵母细胞具有修复精子DNA裂缝的某些修复机制[21,22]我们的研究还发现，当精子DNA片段增加>30%时，对人类胚胎中的囊胚扩张没有影响。内细胞质量和滋养层等级也与精子DNA片段增加无关（>30%）。

使用精子选择方法，例如密度梯度离心和向上游动，可促进选择TEL-DNA（端粒DNA）重复数最大的精子，这有助于提高胚胎质量。此外，如[23-25]中的各种研究所证明的，在高DFI样本中使用的新的精子选择方法，如磁辅助细胞分选，也可以改善ICSI结果。

最常见的缺陷是单链和双链DNA断裂。其他缺陷包括基删除和基修改。此外，还可以有股间和股内交叉连接。

在染色单体融合之前，成熟精子中的单链断裂和基本dna可以通过卵母细胞通过BER (Base excision Repair)途径修复[26,27]。双链断裂可以通过NHEJ(非同源端连接)和HR(同源重组)途径[28]修复。在合子期，非同源端连接机制有助于修复双链断裂。然而，同源重组在第一胚胎阶段的细胞复制阶段有帮助[29,30]。

一些研究强调了抗氧化治疗和精索静脉曲张修复对防止精子DNA碎片的作用。短时间的禁欲和实验室对精子的适当处理可以防止精子DNA碎片。TESA -ICSI也可以帮助防止在附睾和输精管运输过程中由于氧化应激而导致的精子DNA碎片。

精子DNA缺陷可能有多种病因和机制。精子DNA片段分析是对常规精液分析的补充。精子DNA缺陷的类型、部位和严重程度以及卵母细胞修复能力决定生殖结局。在未来的研究中，需要比较各种精子选择标准。卵母细胞修复精子DNA缺陷的机制也需要确定。

精子DNA碎片检测对不明原因的不育症是一项有用的研究。随着父亲年龄的增加，DNA片段增加。精子数;精子活力和形态与精子DNA碎片指数无显著相关性。此外，精子DNA片段与ICSI周期中第5天胚胎分级无显著相关性。这些初步发现需要进一步的大样本前瞻性研究来证实。

作者感谢ARC机构小组和Saveetha医学和技术科学研究所为开展研究提供的基础设施和支持。

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